Созданный в 2020 году на базе Института персонализированной медицины ГНЦ РФ ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России (далее – Центр) Национальный центр мирового уровня по эндокринным заболеваниям недавно пополнился новым функциональным подразделением.
В структуре лаборатории клеточных технологий Центра начала активно функционировать Группа проточной цитометрии и сортировки клеток. Ее инструментальная часть обеспечена технологией (методом) проточной цитометрии. Данный метод используется как в фундаментальных исследованиях, так и в клинической практике и клинических испытаниях для обнаружения и измерения физических и химических характеристик популяции клеток или частиц. Анализируя клетки в суспензии с помощью лазерных технологий, можно производить их подсчет и сортировку, обнаруживать микроорганизмы и биомаркеры, измерять размер генома. Важнейшее назначение проточной цитометрии - определять характеристики субпопуляции Т- и В-лимфоцитов периферической крови, чтобы диагностировать и наблюдать в динамике иммунные изменения, которые как правило сопровождают патогенез эндокринных заболеваний. Оценка клеточного состава (иммунофенотипирование) лимфоцитов крови человека – это основной компонент в оценке иммунного статуса.
- Иммунофенотипирование клеток пациентов критично для изучения иммунопатогенеза, многих эндокринопатий и аутоиммунных заболеваний, - отмечает заместитель директора «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России - директор Института персонализированной медицины академик РАН Владимир Чехонин. - Количество и функциональная активность различных субпопуляций лимфоцитов являются Т-клеточными биомаркерами, важными для стратификации пациентов по гетерогенности клинического проявления заболевания, по скорости его прогрессирования и по прогнозу ответа на терапию. Исследования проводятся на высокотехнологичном оборудовании: задействованы 2 проточных цитометра и 2 клеточных сортера. Клеточные сортеры позволяют физически собирать необходимую субпопуляцию клеток в отдельной пробирке и далее направлять эти клетки на последующий анализ, например, для анализа протеома, транскриптома на уровне единичной клетки, или изучать их в культуре, - подчеркнул Владимир Павлович.
Как известно, в развитии заболеваний эндокринной системы важную роль играют нарушения регуляции иммунного ответа. Особенно и, в первую очередь, это касается таких нозологий, как сахарный диабет, тиреопатии, аутоиммунные полигландулярные синдромы, надпочечниковая недостаточность, офтальмопатия, нейроэндокринные опухоли, некоторые формы гипогонадизма. В лечении этих и других тяжелейших хронических болезней людей требуется персонализированный и мультидисциплинарный подход. В «НМИЦ эндокринологии» он реализуется в том числе через объединение клинических исследований в области иммунологии и эндокринологии.
- Исторически в «НМИЦ эндокринологии» сформирован твердый фундамент наработок для получения рекомбинантных аутоантигенов щитовидной железы и выявления иммуногенных эпитопов, создания панелей антител для диагностики латентных форм надпочечниковой недостаточности, - рассказывает заместитель директора «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России по научной работе академик РАН Галина Мельниченко. - В особом приоритете - эндокринные заболевания аутоиммунной природы (на стыке эндокринологии и иммунологии), спектр которых колеблется от распространенных (аутоиммунные поражения щитовидной железы минимум среди 15% населения) до сравнительно редких, но крайне опасных полигландулярных синдромов, последовательно поражающих ряд эндокринных желез и неэндокринных органов.
Для диагностики иммунного ответа используются разные технологии - как «классические» моноплексные методы иммунного анализа (например, непрямая реакция иммунофлуоресценции, иммуноферментный анализ, иммуноблот, иммунонефелометрия, хемилюминесцентный иммунный анализ, радиоиммуноанализ), так и мультиплексные диагностические методы на основе ДНК-, РНК-, белковых и клеточных микрочипов, полимеразной цепной реакции. В последнее время все большее распространение в мире получила технология проточной цитометрии, - подчеркивает Галина Афанасьевна.
- Технология проточной цитометрии пришла из клеточной биологии, - поясняет руководитель Группы проточной цитометрии и сортировки клеток Института персонализированной медицины Центра кандидат биологических наук Марина Логинова. - В основе работы проточного цитометра лежит принцип измерения оптических свойств индивидуальных клеток во время их прохождения через луч лазера. Производится измерение параметров светорассеяния, обуславливаемого величиной клеток и содержимым цитоплазмы, и параметров флуоресценции, вызванной наличием специфических клеточных антигенов, выявляемых с помощью флуоресцентных антител. По сигналу флуоресценции антител, взаимодействующих с поверхностными или внутриклеточными антигенами, можно судить о наличии или изменении экспрессии таргетных антигенов.
Технология проточной цитометрии высокопроизводительна – она позволяет проанализировать тысячи клеток в секунду, идентифицировать иммунофенотип и охарактеризовать функциональную активность множества клеточных популяций в гетерогенной клеточной суспензии. Отличием этой технологии от микроскопии является скорость и возможность одновременного обнаружения на клетке большого числа разных параметров.
Следует подчеркнуть, что проточные цитометры принесли самую настоящую революцию в иммунологию, существенно продвинули вперед исследования в области стволовых клеток и терапии рака, а также различных вирусных инфекций.
Проточная цитометрия, объединенная с технологиями секвенирования транскриптома на уровне единичных клеток и оценки последовательности гена Т-клеточного рецептора позволяет исследовать и вести мониторинг факторов, способствующих развитию аутоиммунитета. Цитометрия дает возможность отследить прогрессирующие иммунные изменения, которые сопровождают патогенез аутоиммунного заболевания и оценить глубину его тяжести. Технология незаменима при мониторинге иммунной системы до и после лечения, позволяя оценивать эффективность терапии. В ближайшее время в Центре планируется внедрить глубокое иммунофенотипирование и анализ ряда субпопуляций лимфоцитов.
Наконец, технология проточной цитометрии незаменима в исследовании и разработке генотерапевтических и клеточных продуктов, основанных на использовании модифицированного клеточного материала, и составляющих сейчас передовую терапию врожденных и онкологических заболеваний.
Множество этапов разработки клеточного продукта требуют контроля, который осуществляется именно цитометрическим путем. Для клеточных продуктов это могут быть оценка направленной дифференцировки клеток и экспрессии таргетных антигенов, проверка жизнеспособности клеток, динамики их метаболической и функциональной активности.
Для генотерапевтических продуктов добавляется оценка эффективности трансдукции вирусного вектора, экспрессии таргетного гена после, например, направленного редактирования, а также оценка трансдукции сигнала с вовлечением определенных внутриклеточных путей, оценка генотоксичности и клеточной гибели. Важным для обоих типов терапии является проверка иммуногенности по различным параметрам иммунного ответа.
Пресс-служба «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России